Введение в биологию рака

1.1 Определение рака

Рак может быть определен как болезнь, в которой группа аномальных клеток растет неуправляемо, игнорируя нормальные правила клеточного деления. Нормальные клетки постоянно подвергаются сигналам, диктующим выбор, должна ли клетка делиться, дифференцироваться в другую клетку или умирать. Раковые клетки развивают автономию от этих сигналов, ведущюю к безконтрольным росту и пролиферации. Если этой пролиферации позволяют продолжаться и расширяться, это может иметь фатальный исход. Фактически, почти 90% канцер-ассоциированных смертельных случаев являются следствием распространения опухоли — процесс, названный метастазированием.

Основа современной биологии канцера базируется на простом принципе — фактически все клетки млекопитающих разделяют подобные молекулярные сети, которые контролируют клеточную пролиферацию, дифференцирование и клеточную смерть. Преобладающая теория, которая подводит базис под исследования в области происхождения  и лечение рака, заключается в том, что нормальные клетки трансформируются в раковые образования в результате изменений в этих сетях на молекулярном, биохимическом и клеточном уровне, и для каждой клетки существует конечное количество путей, посредством которых может наблюдаться это разрушение. Феноменальные достижения в исследовании канцера за прошлые 50 лет дали нам понимание, как раковые клетки развивают эту автономию. Мы теперь определяем рак как болезнь, которая включает изменения или мутации в геноме клетки. Эти изменения (мутации ДНК) продуцируют протеины, которые разрушают тонкий клеточный баланс между делением и состоянием покоя клетки, результируя в клетки, которые продолжают делиться, формируя раковые образования.

1.2  Рак является клональным по происхождению

Текущая догма декларирует, что рак представляет мультигенную, многоступенчатая болезнь, происходящую от единичной аномальной клетки (клональное происхождение) с измененной ДНК последовательностью (мутация). Безконтрольная пролиферация этих аномальных клеток сопровождается второй мутацией, ведущей к умеренной аберрантной стадии. Последовательные циклы мутаций и селективная экспансия этих клеток (естественный отбор) результируют в формирование опухолевой массы (РИС. 1.1 а , b).

enindex1

Рисунок 1.1 a: Клональная экспансия. ак является мультигенной, многоступенчатой болезнью, происходящей от единичной аномальной клетки (клональное происхождение). Изменения в ДНК последовательности ведут к клетке, медленно прогрессирующей в умеренную аберрантную стадию. Последовательные циклы мутаций и естественной селекции приводят к массе аномальных клеток, названной опухолью. Некоторые клетки в опухоли подвергаются дальнейшим циклам мутаций, результируя в формирование злокачественных клеток, которые вызывают метастазирование.

Последующие циклы мутаций и экспансии приводят к росту и прогрессии опухоли, которая, в конечном счете, прорывается через барьер в виде базальной мембраны и распространяется в другие области организма (метастазирование). Смерть, как следствие рака, является результатом инвазии, разрушения и распространения опухолей в нормальные ткани благодаря безконтрольной клональной экспансии этих соматических клеток.

enindex2

Рисунок 1.1b. Клональная экспансия. Нормальные клетки подвергаются сигналам, которые регулируют их пролиферацию и поведение. Все раковые образования утрачивают нормальный контроль за клеточной пролиферацией, и для каждой клетки существует конечное количество путей, посредством которых эта утрата может наблюдаться. Канцерные клетки развивают определенную автономию от внешних регулирующих сигналов, которые ответственны за нормальный клеточный гомеостаз. Множественные мутации ведут к формированию опухолевой массы. Последующие мутации результируют в злокачественную опухоль, которая прорывается через базальную мембрану и распространяется в отдаленные сайты

Свидетельство в пользу модели клональной экспансии может быть продемонстрировано простым, но необычным клиническим примером (РИС. 1.2). Фермент, глюкозо-6-фосфат дегидраза (G6PD) имеет две формы, G6PD-A и G6PD-B, которые отличаются друг от друга одной аминокислотой. У некоторых людей есть клетки, которые содержат или тип A или тип B, но нет клеток содержащих оба фермента, и таким образом, ткани представляют мозаику клеток с этими двумя типами.

Некоторые из этих индивидуумов, заболевающие Хронической Миелоидной Лейкемией (ХМЛ — кровеностный рак) имеют злокачественные миелоидные клетки, все из которых содержат только один тип фермента, или тип A или тип B, но никогда оба, ясно демонстрируя клональное происхождение рака.

enindex3

Рисунок 1.2. Пример, показывающий, что раковые образования клональны по происхождению. Генетический анализ миелоидных клеток у некоторых пациентов с Хронической Миелоидной Лейкемией (ХМЛ — канцер крови) содержит только один тип фермента, G6PD, или тип A или тип B, но никогда оба. Начиная с нормальных тканей с другой стороны, существует мозаика клеток с обоими типами A и B, это ясно демонстрирует клональное происхождение рака

1.3 Понимание рака

Инициирование и прогрессия рака зависят и от внешних факторов окружающей среды (табак, химические вещества, радиация и инфекционные агенты) и внутренних факторов клетки (наследуемые мутации, гормоны, иммунное состояние и мутации в процессе  метаболизма). Эти факторы могут действовать одновременно или  последовательно, приводя к аномальному поведению клеток и избыточной пролиферации. В результате клеточная масса растет и распространяется, изменяя окружающие нормальные ткани (такие как в головном мозге), и может также диссеминировать в другие области организма (метастазирование). Однако, важно помнить, что в наиболее распространенных раковых образованиях необходимы месяцы и годы для аккумуляции этих ДНК мутаций и формирования выявляемого канцера.

Раковые образования возникают приблизительно у одного из каждых 3 индивидуумов. Мутации ДНК в обычных условиях возникают с частотой 1 на каждые 20 миллионов из расчёта на ген на клеточное деление. Среднее количество клеток, формируемых у какого-либо индивидуума в течение средней продолжительности жизни, составляет 1016 (10 миллионов клеток, замещаемых каждую секунду!). Поэтому было бы логично предположить, что популяции людей в какой-либо точке мире покажут сходную частоту рака. Однако, заболеваемость канцером (количество диагностированных индивидуумов) резко варьируют между странами. Очевидно, некоторые факторы, видимо, вмешиваются с резким увеличением инцидента канцера в некоторых популяциях. Очевидный вывод заключается в том, что предрасполагающие факторы, которые вызывают рак, являются либо наследуемыми, либо средовыми. Это означает, что или определенные популяции несут большое количество генов восприимчивости к канцеру, или окружающая среда, в которой находятся популяции, в значительной степени способствует заболеваемостью раком.

1.4 Причины рака (этиология рака)

Что из двух — гены или окружение — играют доминирующую роль в развитии рака? В то время как гены распределены неравноценно через популяции, они не объясняют различия в раковых заболеваемостях в мире. Это продемонстрировано наиболее показательно на следующем примере. Частота рака желудка в 6-8 раз выше среди японцев по сравнению с американцами. Однако, дети эмигрировавших в Америку японцев имеют заболеваемость раком желудка, сопоставимую с заболеваемостью в американской популяции. Поэтому, риск развития рака видится в значительной степени средовым, составляющем более 90% всех вызванных канцерных образований.

1.4.1 Образ жизни и окружающая среда

Первое известное сообщение, связывающее влияние образа жизни с раком, было сообщение John Hill, английского врача, который замечти связь между раком носа и использованием нюхательного табака. В конце 18-ом столетия, сэр Percival Pott сообщил, что рак мошонки у трубочистов был связан с плохой гигиеной и накоплением вызывающих рак агентов в саже. Датская Гильдия Трубочистов рекомендовала ежедневные ванны, что было наиболее вероятной причиной для драматического снижения заболеваемости раком мошонки в Европе.

В 1950, убедительные эпидемиологические данные показали, что часто курящие люди имеют в 20 раз выше риск развития рака легких по сравнению с некурящими. С тех пор, курение и потребление спирта связывают почти с ~170 000 летальными исходами рака рта и гортани ежегодно в одних только США (Рис. 1.3). Более чем полмиллиона смертельных случаев каждый год, ожидают, будет вызвано ожирением, физической пассивностью, диетой (малое потребление овощей, избыток соли или нитратов связаны с канцером желудка и пищевода, тогда как чрезмерно жирная пища с малым количеством клетчатки связаны с раковыми образованиями кишечника, поджелудочной и молочной желез и простаты).

enindex4

Фигура 1.3: Процент раковых образований, приписываемых избыточному потреблению спирта и использованию табака. Избыточное потребление спирта связано с раковыми образованиями печени и рта/гортани как у мужчин, так и у женщин. Риск рака молочной железы высок у женщин, которые выпивают больше алкоголя. Курение и использование табака достоверно увеличивает риск рака легких и у мужчин, и у женщин, и также немного выше риск раковых образований рта/гортани. Источник: SEER обзор статистики канцера, НИР, США

Другие раковые образования, вызванные возбудителями инфекции, включая вирусы [вирус гепатита B (HBV), вирус папилломы человека (HPV), вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) — которые вызывают носоглоточные, цервикальные карциномы и саркому Капоши] и бактерии, такие как Helicobacter pylori (раковые образования желудка). Частота раковых образований кожи (меланомы) повышается, особенно в Австралии, в результате экспозицию высоким уровням ультрафиолетового излучения солнца и популярности соляриев. Однако риск развития этих раковых образований может быть снижен путем изменения образа жизни, использованием вакцин и антибиотиков.

Инициирование и прогрессия рака также являются следствием действия канцер-вызывающих агентов (канцерогенов, мутагенов). Они присутствуют в пище и воде, в воздухе, в химических веществах и солнечном свете, которым экспонируются люди. Поскольку эпителиальные клетки покрывают кожу, выстилают дыхательные пути и пищеварительные тракты, и метаболизируют принятые внутрь канцерогены, не удивительно, что более 90% раковых образований происходят из эпителия (‘карциномы’). В менее чем 10% случаев генетическая предрасположенность повышает риск развития рака в более ранние сроки. Например определенные лейкозы детства, ретинальные раковые образования и т.д.

1.4.2 Возраст

Хотя рак может наблюдаться у людей любого возраста, он наиболее распространен среди популяции пожилых (РИС. 1.4). Шестьдесят процентов новых случаев канцера и две трети летальных исходов рака наблюдаются в людей старше 65 лет. Частота  распространенных раковых образований (например, молочной железы, колоректального отдела кишечника, простаты и легких) увеличивается с возрастом.

Несколько теорий пытаются объяснить, почему частота рака увеличивается у пожилых: возрастные альтерации иммунной системы (сниженное иммунное наблюдение); аккумуляция случайных генетических мутаций или длительная экспозиция канцерогенов (особенно для колоректального и рака легких); гормональные нарушения или экспозиции; и высокая продолжительность жизни.

Необходимость множественных генетических изменений для развития рака наиболее ярко иллюстрируется пошаговыми генетическими изменениями, которые демонстрируют многие полипы толстого кишечника, прогрессирующие в канцер.

Экспоненциальный рост частоты многих раковых образований с возрастом связан с повышенной восприимчивостью в позднем периоде к канцерогенезу, индуцированному средовыми экспозициями. Экспозиция эстрогена в течение жизни может привести к раку молочной железы или матки; экспозиция тестостерона — к раку простаты. Снижение клеточного иммунитета может также привести к определенным типам рака, которые высоко иммуногены (например, лимфомы, меланомы). Аккумуляция ДНК мутаций должна быть усилена для формирования рака, поэтому чем длинее продолжительность жизни, тем выше риск развития рака.

enindex5

Рис. 1.4: Возрастная частота и летальность для всех типов раковых образований. Источник: SEER Обзор Статистики Канцера, НИР, США

1.5  Идентификация и гистопатология раковых образований

Почему мы должны идентифицировать и классифицировать раковые образования? Есть несколько успехов к идентификации и классификации раковых образований, используя гистологические секции и методы окрашивания

  1. Диагноз: Микроскопическое наблюдение помогает определить, является ли ткань опухоли доброкачественной (безопасной) или злокачественной (потенциально фатальной). Грубая клеточная морфология и ткань-специфичные маркеры используются для классификации злокачественных клеток.
  2. Терапия: Патология может использоваться как подтверждение или для прогноза. Например: хирург удалил всю опухоль? Или было ли лечение эффективно в отношении элиминации опухолей? Или какова частота прогрессии рака? Прогрессия может быть предсказана гистотипированием. Например, пациенты с простой гиперплазией в эпителии матки имеют <1%-ый риск развития рака по сравнению с 82%-ым риском у больных с атипичной гиперплазией.
  3. Клеточное происхождение (гистогенез): Определение источников опухоли в соответствии с гистопатологической классификацией ткани полезно a) для идентификации, является ли опухоль первичной или вторичной, например, опухоль печени может представлять метастаз из другой области организма или b) для выявления источника происхождения опухоли, например, рак легких в результате курения является эпителиальным (карцинома легкого), а в результате экспозиции асбеста является мезотелиальным (мезотелиома* или асбестовый рак).

*Что такое — мезотелиома? Мезотелий — слой клеток, которые покрывают различные органы в организме, защищая их и позволяя органам перемещаться относительно друг друга, подобно расширению легких или биению сердца. Мезотелий, окружающий легкие и выстилающий грудную полость, называют плеврой, таким образом мезотелиомы, которые поражают клетки, выстилающие мешки вокруг легких, называются плевральными мезотелиомам. Когда рак поражает абдоминальную выстилку, или брюшину, он называется перитонеальной мезотелиомой.

1.6 Шесть признаков рака

Мутации ДНК результируют в дефекты в регулирующих цепях клетки, которые нарушают пролиферативное поведение нормальной клетки. Однако эта болезнь не столь проста на клеточном и молекулярном уровне. Индивидуальное поведение клеток не автономно, и, как правило, подчиняется внешним сигналам от окружающих клеток ткани или микросреды. Существует более 100 отличительных типов раковых образований, и любой специфичный орган может содержать опухоли более одного подтипа. Это вызывает несколько вопросов. Сколько из этих регулирующих цепей должно быть поломано для трансформирования нормальной клетки в злокачественную? ломается ли общая регулирующая цепь в различных типах раковых образований? Какие из этих цепей поломаны в клетке и какие из них связаны с внешними сигналами от соседних клеток ткани?

Ответы на эти вопросы могут быть суммированы в гетеротипической модели, проявляясь как шесть общих изменений в клеточной физиологии, которые ведут к раку (предположена Douglas Hanahan и Robert Weinberg в 2000). Эта модель рассматривает опухоли как на сложные ткани, в который раковая клетка задействует и использует нормальные клетки для повышения собственной выживаемости и пролиферации. 6 признаков этой в настоящее время принятой модели могут быть описаны, используя аналогию с светофором (Рис. 1.5).

  • Иммортализация: непрекращающееся клеточное деление и неограниченная репликация
  • Продукция «разрешающих» сигналов (сигналы роста от онкогенов)
  • Утрата «стоп» сигналов (антиростовые сигналы от опухоль-супрессорных генов)
  • Резистентность к клеточной смерти (апоптозу)
  • Ангиогенез: индукция роста новых кровеностных сосудов
  • Метастазирование: распространение в другие области

enindex6

enindex7

Рисунок 1.5. Шесть признаков рака. Почти все рак

овые образования разделяют некоторые или все 6 черт, описанных ниже, в зависимости от типа опухоли. Некоторые опухоли могут демонстрировать все эти изменения вследствие мутаций в одном ключевом гене (например, p53 ген контролирует по крайней мере 4 из этих черт), тогда как другие опухоли, возможно, нуждаются более чем в 1 мутации для прогрессии. Стрелки справа (оранжевая и красная) показывают сигналы, которые регулируют поведение нормальных клеток. Зеленые стрелки слева показывают аномальный рост, инициированный раковыми клетками. Зеленые блоки выделяют 6 ключевых характеристик раковых клеток.

2. Иммортализация: непрекращающееся деление клеток

Все организмы имеют определенный размер и форму, и на тканевом, и на клеточном уровне. Почти все типы клеток млекопитающих несут встроенную цепь, которая контролирует частоту их клеточного деления. Этот контроль является витальным для поддержания целостности клетки и ткани. Если клетки продолжают делиться неуправляемо без какого-нибудь внутреннего контроля, ткани могут потенциально достигать огромных размеров с летальным исходом для организма. Например, у людей потенциально могут быть большое сердце, увеличенные легкие или печень.

Раковые клетки обычно определяются их способностью делиться неуправляемо. Для клона клеток, чтобы достигнуть размера потенциально фатальной опухоли, необходимо разрушение наследственной клеточной цепочки (circuitry), контролирующей клеточный прирост. Давно известно, что у нормальных клеток млекопитающих, которые растут в чашках Петри, имеется конечное количество клеточных делений. Например, можно взять взрослые фибробластные клетки, культивировать их в чашке Петри in vitro и, когда клетки достигают края чашки Петри, они прекращают умножаться. Когда небольшая часть этих клеток переноситься в другую чашку Петри, они вновь начинают делиться и так далее, — процесс, названный пассированием. Однако, после определенного числа переносов, частота клеточного деления замедляется и, в конечном счете, останавливается (Рис. 2.1).

enindex8

Рисунок 2.1. Способность к клеточному делению. В культуре, нормальные клетки подвергаются конечному числу делений прежде, чем они полностью прекратят делиться (старение).  У раковых клеток имеется потенциал к бесконечному количеству клеточных делений.  Изображение показывает нормальные клетки, которые растут в чашке Петри.

Leonard Hayflick первым продемонстрирол, что у клеток от грызунов или человеческих эмбрионов имеется конечное число клеточных делений (репликационный потенциал), и он назвал это старением. Стареющие клетки жизнеспособны, но теряют способность к клеточному обороту и клеточному делению. В чашках Петри эти клетки будут потреблять питательные вещества и расти (часто выглядят похоже на яичницу — глазунью, поскольку ядро и цитоплазма вырастают в размере), но не будут делиться. Как правило, большинство нормальных типов клеток человека имеет способность для 60-70 удвоений.

В полном контрасте к нормальным клеткам, культивируемые раковые клетки обладают способностью резко превышать период нормальных удоений до почти неопределенного уровня (Рис. 2.1). Необычный пример этого — клетки HeLa. Первоначально культивируемые из цервикальной аденокарциномы от больного раком по имени Henrietta Lacks в 1951, эти клетки продолжают расти и пролиферировать в сотнях лабораторий во всем мире по сей день. Это ясно предполагает, что эти раковые клетки обошли/разрушили регуляторы старения внутри клетки и приобрели способность неограниченного деления (репликационный потенциал).

За прошедшие 30 лет был открыт клеточный механизм, контролирующий старение. Мы теперь знаем, что детектор, который контролирует предел клеточного деления, находится на конце всех человеческих хромосом — это теломеры. Теломеры — гексануклеотидные последовательности ДНК (короткие повторы 6 пар азотистых оснований), и каждый конец линейной хромосомы содержит тысячи копий этих повторов.   Например, у людей повторяющаяся последовательность — TTAGGG. Эти последовательности считаются «отходами», то есть они не кодируют ни какие протеины. Однако, они играют витальную роль в защите хромосом. Они действуют путем предотвращения соединения концов хромосом по типу конец-в-конец и также защищают ДНК от деградации нуклеазами. Теломеры походят на «аглеты», которые защищают концы шнурков от изнашивания.

Важность теломер в клеточном делении определена уникальной проблемой ДНК репликация, названной ‘проблемой репликации конца’ (РИС. 2.2). Во время клеточного деления, ДНК реплицируется во время S фазы клеточного цикла, создающего удвоенное количество хромосом. Каждый набор затем делится между каждой дочерней клеткой во время митоза. Однако, после каждого круга ДНК репликации, короткая последовательность (50-100 пар азотистых оснований) теломеры теряется с концов каждой хромосомы. Это прогрессивное укорочение является следствием неспособности фермента, ответственного за синтез ДНК, ДНК полимеразы, копировать эти 50-100 пар азотистых оснований на конце одной цепочки ДНК (3’ конец). В результате каждый круг ДНК репликации результирует в деградацию этих последовательностей и все более короткие хромосомы. Так как у каждой хромосомы есть конечное количество этих теломерных повторов, последовательные циклы репликации результируют в устойчивую эрозию теломер, пока они не вызывут генетические изменения, хромосомные слияния конец-в-конец и перестройку, и в конечном счете клеточную смерть. Таким образом, у каждой нормальной клетки есть конечная продолжительность жизни, продиктованная длиной ее теломер.

enindex9

Рис. 2.2. Теломеры — наконечники хромосом. Теломеры представляют повторяющиеся ДНК последовательности, которые защищают линейный конец хромосом. После каждого цикла клеточного деления, длина теломер прогрессивно укорачивается, пока она не побуждает клетку прекратить делиться и вступить в старение. Раковые клетки предотвращают сокращение теломер, продуцируя фермент, теломеразу, которая продолжает наращивать теломеры, таким образом предотвращая старение клетки.

Раковые клетки с другой стороны, поддерживают длину своих теломер без какой-либо утраты пар азотистых оснований ДНК. Мы теперь знаем, что главная стратегия, используемая раковыми клетками для поддержания длины теломер, увеличивая экспрессию фермента, названного теломеразой. Почти 85-90% всех раковых образований имеют активную теломеразу.

Теломеразы добавляют гексануклеотидные повторы на концы теломерной ДНК, таким образом поддерживая заданные длины выше критического порога, предотвращая эрозию и позволяя неограниченную репликационную способность. В отличие от раковых клеток, в активно делящихся нормальных клетках уровни теломеразы которые чрезвычайно низки или невыявлены. Если теломераза инъецируется в эти клетки in vitro, они трансформированы в клетки, которые продолжают делиться неограниченно. Дополнительное свидетельство для важности теломераз в поддержании теломер прибывает из опухолей, которые распространились в отдаленным области организма (метастазы), которые также показывают высокие уровни экспрессии и активности теломеразы.

Другая интересная черта теломераз состоит в том, что они высоко экспрессируются в герминативных клетках (сперма и яйцеклетки) и эмбриональных стволовых клетках (ЭС клетках), но постепенно уменьшаются в процессе развития во взрослых соматических клетках. Раковые стволовые клетки поэтому могут произходить из нормальных стволовых клеток, прогениторных клеток, или возможно соматических клеток и могут быть бессмертными, имея способность неопределенного самообновления и пролиферации.

Упомянутое выше свидетельство предполагает, что старение вероятно представляет защитный механизм, используемый клетками для вступления в фазу покоя (G0), таким образом избегая стрессорных состояний и приостанавливая пролиферацию. Опухоли обходят пути старения активируя теломеразы для гарантии их пролиферацию. Поэтому терапевтические стратегии, направленные на ингибирование теломеразах, предпочтительно убивают опухолевые клетки и не оказывают токсического действия на нормальные клетки. Однако, еще обсуждается факт, что старение — артефакт условий клеточного культивирования, а не истинное представление фенотипа в организме (in vivo). Разрешение этих дебатов будет полезно для понимания, как связаны между собой репликационный потенциал и прогрессия опухоли.

3. Длительные сигналы к росту (онкогены*)

Ни одна клетка не может жить изолированно. Каждая клетка — часть сообщества, которое формирует ткань или орган. Клеточное поведение почти всегда зависит от ростовых сигналов (митогенных) из окружающей среды, которые инициируют клеточное деление. Эти внешние факторы роста (или лиганды) связываются с мембрана-ассоциированными гликопротеиновыми рецепторами, которые передают сообщение через серию внутриклеточных сигналов, способствующих или ингибирующих экспрессию специфичных генов (РИС. 3.1). Примеры ростовых сигналов включают диффундирующие факторы роста, протеины внеклеточного матрикса и межклеточные адгезивные/ взаимодействующие молекулы. Если эти ростовые сигналы отсутствуют, то любая типичная нормальная клетка будет перемещаться в состояние покоя вместо активного деления. Эта зависимость от экзогенных факторов роста — критический гомеостатический механизм для контроля за клеточным поведением в пределах ткани.

enindex10

*Что такое онкогены? Онкоген представляет ген, который кодирует протеин, способный трансформировать клетки в культуре или индуцировать рак у животных. Эти онкогены — производные генов нормальных клеток, названных протоонкогенами. Протоонкогены кодируют протеины, которые стимулируют деление клеток, но мутантные формы, названные онкогенами, делают стимулирующие протеины сверхактивными, в итоге приводя к чрезмерной пролиферации клеток. Онкогены доминируют над протоонкогенами.

Раковые клетки, с другой стороны, генерируют мутантные протеины (онкогенные протеины), которые имитируют эти нормальные ростовые сигналы (прото-онкогенные протеины). Трансформация протоонкогенов в онкогены вызвана несколькими факторами, такими как мутации, хромосомные перестройки, вирусные инсерции, амплификации генов и т.д. Последствие онкогенной трансформации в том, что опухолевые клетки становятся независимыми от внешнего сигналинга факторами роста в любой нормальной тканевой микросреде. Эта приобретенная опухолевыми клетками черта может быть продемонстрирована эмпирически in vitro.

Нормальные клетки (например, фибробластные клетки кожи), которые культивируются в чашке Петри in vitro, не будут делиться и пролиферировать в отсутствии факторов роста, найденных в сыворотке. Опухолевые клетки с другой стороны могут активно пролиферировать без зависимости от этих факторов роста. Эта автономия от сигналинга факторами роста приводит к нерегулируемому росту (такой как в отсутствии идеальных состояний для клеточного деления или при стрессе) и увеличивает возможности приобретения дальнейших мутаций в клеточном геноме.

enindex11

Рис. 3.1. Компоненты типичного сигнального каскада факторов роста. Факторы роста — гормоны и клетка-фиксированные сигналы, которые стимулируют клеточную пролиферацию. Рецепторы являются мембраносвязанными протеинами, которые принимают сигналы. Сигнальные трансдукторы — молекулы (протеины и другие), которые передают сигнал от рецептора к другим внутриклеточным молекулам, вовлеченным в клеточную пролиферацию. Транскрипторный фактор — протеины, которые связываются с ДНК и инициируют экспрессию протеинов, вовлеченных в клеточную пролиферацию.

enindex12

Рис. 3.2: Альтерации ростовых сигналов. Тромбоцит-продуцируемый фактор роста — протеин, необходимый клеткам для стимулирования клеточного деления. В нормальных условиях PDGF связывается с внеклеточным доменом своего рецептора и стимулирует внутриклеточные пролиферативные пути. Определенные раковые образования развиваются вследствие гиперпродукции PDGF протеинов или когда клетки инфицируются определенными вирусами, повышенно продуцирующими PDGF-подобный онкопротеин, который также связывается с PDGF рецептором.

enindex13

Рис. 3.3: Альтерации рецепторов. Мутации в рецепторе эпидермального фактора роста (EGFR) ведут к длительной и лиганд-независимой стимуляции рост-стимулирующих внутриклеточных путей. Это вовлечено в инициирование и прогрессию определенных типов рака молочной железы.

Существуют три главных клеточных стратегии, используемые раковыми клетками для достижения рост-факторной автономии, базируемой на сигнальном пути факторов роста, как показано на рисунке 3.1.

a)       Изменения во внеклеточных ростовых сигналах

b)       Изменения в трансклеточных медиаторах этих сигналов (рецепторы)

c)       Изменения во внутриклеточных сигнальных посредниках (мессенджерах), которые стимулируют пролиферацию.

a)       Изменения во внеклеточных ростовых сигналах. Большинство растворимых митогенных факторов роста (GF) являются гетеротипическими (формируемые одним клеточным типом для стимуляции пролиферации другого), но многие раковые клетки демонстрируют аутокринную стимуляцию (генерируют GF для собственного клеточного типа), таким образом уменьшая зависимость от GF из других клеток в пределах ткани. Многие рецепторы факторов роста, цитоплазматические и ядерные эффекторы были идентифицированы как онкогены. Продукция PDGF (тромбоцит-продуцируемого фактора роста) опухолью головного мозга, названной глиобластомой, — один из примеров этого. Клетки, инфицированные вирусным онкопротеином v-sis, имеют тенденцию высвобождать большое количество PDGF-подобных онкопротеинов (PDGF-β), которые соединяются с PDGF рецепторами этой же клетки. Это вызывает аутокринную сигнальную петлю, в которой клетка генерирует собственный факторо-ростовой сигнал, результирующий в конститутивную стимуляцию роста (РИС. 3.2).

b)       Изменения в трансклеточных сигналах (рецепторах). Рецепторы на клеточной поверхности, которые переносят стимулирующие рост сигналы внутрь клеток, является самостоятельными мишениями дерегуляции во время опухолевого патогенеза. Мутации или изменения в количестве или типах рецепторов, экспрессируемых клеткой, могут трансформировать ее в раковую клетку. Самая распространенная группа рецепторов, вовлеченных в несколько раковых образований, принадлежит тирозинкиназной семье. Они включают EGF, FGF, IGF, PDGF рецепторы (эпидермальный фактор роста, фибробластный фактор роста, инсулиновый фактор роста, тромбоцит-продуцируемый фактор роста). Некоторые примеры этих изменений могут включать

  • Избыточная экспрессия. GF рецептор часто повышенно экспрессируются во многих раковых образованиях и раковые клетки становятся гиперчувствительными к уровням GF, которые в нормальных условиях не инициировали бы клеточное деление. Например, в определенных типах рака молочной железы (карциномы молочной железы), HER2/neu рецептор повышенно экспрессируется, приводя к гиперпролиферации.
  • Лиганд-независимый сигналинг. GF-независимый сигналинг может быть вызван или грубой избыточной экспрессией рецепторов или структурными изменениями в рецепторе. Например, усеченный рецептор эпидермального фактора роста (благодаря делеции в экзонах 2-7 внеклеточного домена) по прежнему посылает рост-стимулирующие сигналы в клетки без какого-либо EGF связывания (РИС. 3.3).
  • Рецепторный свичинг (switching). Раковые клетки могут также менять типы экспрессируемых рецепторов. Например, раковые клетки предпочтительно экспрессируют рецепторы внеклеточного матрикса (интегрины), которые благоприятствуют росту. Интегрины — бифункциональные рецепторы на клеточной поверхности, которые связывают клетки с внеклеточными суперструктурами, известными как внеклеточный матрикс (ВКМ). Сигнальные молекулы в ВКМ позволяют интегриновым рецепторам передать в цитоплазму сигналы, которые меняют клеточное поведение от состояния покоя в нормальной ткани к подвижности, резистентности к апоптозу и вступлению в активный клеточный цикл в раковых клетках.

c)       Изменения во внутриклеточных сигнальных путях, которые стимулируют пролиферацию. Самый распространенный, но сложный механизм канцерной трансформации происходит от изменений в компонентах внутриклеточного, цитоплазматического сигнального каскада, который получает вход от лиганд-активированных рецепторов факторов роста на клеточной мембране. Мутации в протеинах, входящих во внутриклеточный сигнальный каскад (адапторные протеины), найдены в большинстве опухолей человека. Примеры мутаций в каждом компоненте этого внутриклеточного сигнального пути в раковых образованиях человека показаны ниже.

Пример 1 — клеточный цикл-ассоциированная киназа (c-crk): Эти небольшие адапторные протеины (~60 аминокислотных остатков) были впервые идентифицированы как консервативная последовательность в некаталитической части нескольких цитоплазматических тирозинкиназ, таких как Abl и Src, а позже — в нескольких других семьях протеинов, таких как фосфолипазы, PI3 киназа, ras ГТФаза-активирующий протеин, адапторные протеины, CDC24 и CDC25. Эти протеины содержат только SH3 и SH2 домены, из которых SH2 домены связывают фосфорилированные тирозиновые остатки, в то время как SH3 домены связывают богатые пролином последовательности в лигандных протеинах. Главная функция протеинов C-crk заключается в доставке субстратных протеинов к тирозинкиназным рецепторам (TKR). Вирусный онкопротеин, Bcr-Abl, действует как субстрат для c-crk, вызывая продолжительную активацию тирозинкиназных рецепторов и результируя в клеточную пролиферацию (Рис. 3.4). Активация TKR c-crk протеинами включена в некоторые хронические миелогенные лейкозы человека (ХМЛ).

enindex14

Рис. 3.4. Активация тирозинкиназных рецепторов посредством c-crk.

Пример 2 — Ras (rat sarcoma). Ras, возможно, является одним из наиболее хорошо изученных онкопротеинов и представляет компонент SOS-Ras-Raf-MAP киназного митогенного каскада. Приблизительно 25% опухолей человека и 90% всех опухолей поджелудочной железы имеют мутантную форму внутриклеточной сигнальной молекулы Ras (небольшая ГТФ-связанная сигнальная молекула). Ras протеины связаны с ГДФ в неактивном состоянии, но при стимуляции через GEF (гуаниновые нуклеотид-обменивающие факторы) активируются, связываясь с ГТФ (Рис. 3.5). Далее Ras функционирует как ГТФаза, используя GAP (ГТФаза-активирующие протеины), которая гидролизует ГТФ и досягает неактивного состояния.

В опухолях обычно единственная точковая мутация трансформирует нормальный Ras в Ras онкопротеин, в котором утрачена активность ГТФазы, приводя к постоянно активному Ras и раковой клетке, которая не может «выключить» ее пролиферативный статус. Альтернативно, пути Ras активации могут быть разрушены или благодаря онкопротеинам или мутациям в регулирующих путях (как показано во вставке на рис. 3.5).

enindex15

Рис. 3.5. Изменения в Ras сигналинге. Ras является витальным в нескольких сигнальных путях, и действует как бинарный переключатель. Связывание ГДФ (Гуаниновый нуклеотид ДиФосфат) в неактивном состоянии и ГТФ (Гуаниновый нуклеотид ТриФосфат) в его активном состоянии (когда стимулирует GF сигналинг). Неактивный Ras активируется GEF (Гуаниновые нуклеотиды-обменивающий фактор), замещая ГДФ на ГТФ. Этот шаг является недолгим, поскольку Ras имеет внутреннюю  ГТФазную активность, которая означает, что ее ГТФ гидролизируется до ГДФ (фосфатная группа удаляется), таким образом реверсируя обратно в неактивное состояние. Эта ГТФазная активность инициируется GAP (ГТФаза-активирующие протеины). Мутации или онкопротеины, которые блокируют ГТФазную функцию, фиксируют Ras в перманентно активном, сигнальном состоянии.

В течение последних двух десятилетий наблюдались интенсивные изучения сигнальных путей, вовлеченных в клеточный рост и пролиферацию. Новые мишени, расположенные выше и ниже ключевых путей, открываются, исправляются и связываются друг с другом, позволяя внеклеточным сигналам вызывать множественные биологические действия. Один способ смотреть на сложность сигнальных путей, думая о доске электронной схемы, где транзисторы замещены ключевыми регуляторными протеинами, которые действуют как двоичные переключатели (такие как фосфатазы и киназы). Сигналы или изнутри или снаружи клетки передают сообщения роста или состояния покоя, выживания или смерти.

4. Обход антиростовых сигналов (опухоль-супрессорных генов*)

Баланс между клеточной пролиферацией и состоянием покоя достигается сложным взаимодействием между этими двумя сигнальными путями. Глава 3 выдвигает на первый план роль положительных активных ростовых и пролиферативных путей, опосредованных сигнальными GF каскадами. Однако, нормальные ткани также подвергаются антипролиферативным сигналам, которые ответственны за клеточное покой и действуют как «тормоза» для пролиферативных сигналов (отрицательные регуляторы клеточного деления). Эти сигналы могут включать растворимые ингибиторы роста и ингибиторы, находящиеся во внеклеточном матриксе и на клеточной поверхности.

Подобно GF сигнальным путям, сигналы, которые в нормальных условиях супрессируют / блокируют клеточное деление, также воспринимаются клеточно-поверхностными рецепторами, которые связаны с внутриклеточными сигнальными путями. Гены, которые кодируют этот класс протеинов, вовлеченных в ограничение деления нормальных клеток, называют опухоль-супрессорными генами. Эти антиростовые сигналы близко ассоциированы с часами клеточного цикла, которые контролируют прогрессивное клеточное деление через митоз.

Нормальные клетки, до клеточного деления, постоянно мониторируют свою внутреннюю и внешнюю среду для гарантии, что состояние — идеальное для митоза. Сигналы из внешней или внутренней среды диктуют, должна ли клетка делиться, или находится в покое, или вступить в постмитотическое состояние или разрушить саму себя. Например, наличие протеинов, вовлеченных в ДНК репликацию в конце G1 фазы, направляет клетку в S фазу, тогда как тяжелое повреждение ДНК может инициировать убийство клетки самой себя путем апоптоза. Эти checks обеспечивают критический гомеостатический механизм для прогрессирования к клеточному делению в нужное время и в оптимальных состояниях роста.

* Что такое — опухоль-супрессорные гены (TSG)? TSG кодируют протеины, которые в нормальных условиях ингибируют клеточное деление. Любые мутации, которые ведут к функциональной инактивации этих протеинов, называются как «мутации утраты функции» (loss-of-function mutation), поскольку удаляются обычные тормоза пролиферативной способности. Функциональная активность TS протеинов может также нарушаться ингибиторными/конкурирующими онкопротеинами или вследствие дерегуляции (статус фосфорилирования).

enindex16

Как правило, антиростовые сигналы работают двумя отличительными путями

a)       Вынуждая активно делящиеся клетки вступить в фазу покоя (G0) клеточного цикла, что может быть временной мерой, пока есть изменение в пролиферативной способности (или изменение в состоянии микросреды или в GF сигнале).

b)       Клетки могут быть индуцированы в перманетное постмитотическое (неделящееся) состояние как результат развития. Например, специфичное окончательное дифференцирование нейронов или состояние денуклеации зрелых эритроцитов.

Раковые клетки, с другой стороны, обходят или уклоняются от этих антиростовых сигналов, чтобы позволить себе расти и пролиферировать. Например, мутации в генах, которые в нормальных условиях ингибируют клеточную пролиферацию, результируют к повышенное клеточное деление. Эти опухоль-супрессорные гены (TSG) составляют большую группу генов, кодирующих протеины, нормальная роль которых заключается в сдерживании клеточного деления. Мутации в этих генах ведут к утрате функции (loss-of-function мутации) и обычно, обе копии (аллели) гена должен быть изменены для формирования опухоли (в отличие от онкогенов, у которых имеется мутация усиления функции — gain-of-function мутация).

Одним из наиболее хорошо изученных примеров опухоль-супрессорных протеинов является ретинобластомный (Rb) протеин, вовлеченный в формирование редких опухолей сетчатки глаза у детей. Большинство мутаций в Rb гене представляют грубые хромосомные изменения в 3 кб кодирующей области гена, и приблизительно треть составляют мутации единичных оснований.

На молекулярном уровне, Rb протеин (pRb) и два его родственника, p107 и p130, возможно регулируют большинство антиростовых сигналов в клетке. В гипофосфорилированном состоянии pRb блокирует пролиферацию, секвестрируя и изменяя функцию ключевого транскрипторного фактора E2F, который контролирует экспрессию множества генов, необходимых для прогрессии клеточного цикла из G1 в S фазу.

enindex17

Альтерации pRb пути (вследствие либо мутаций, либо гиперфосфорилирования pRb) высвобождают E2F и ведут к клеточной пролиферации, поскольку клетки становятся нечувствительными к антиростовым факторам, которые в нормальных условиях действуют вдоль этого пути для блокирования прохода через G1 фазу клеточного цикла.

pRb сигнальная цепь может быть разорвана на множественных шагах в различных типах опухолей человека. Например, путем снижения регуляции/разрушения рецепторов и сигнальных молекул выше pRb цепи или утраты функционального pRb в результате мутаций. Альтернативно, в определенных ДНК вирус-индуцированных опухолях, таких как цервикальные карциномы, вирусные онкопротеины, подобные E7 онкопротеину вируса папилломы человека, секвестрируют pRb, приводя к утрате функции (Рис. 4.1). В целом, антиростовые пути, который конвергируют на pRb, разрываются в большинстве раковых образований человека, выдвигая на первый план концепцию утраты опухолевых супрессоров в раке.

enindex17

Рис. 4.1. Прогрессия опухоли путем секвестрации Rb протеина. Вирус человеческой папилломы (HPV) является главным причинным фактором для цервикальных раковых образований. Длительная экспозиция и другие факторы образа жизни позволяют HPV E7 онкопротеину секвестрировать Rb, оставляя транскрипторный фактор E2F свободным для транскрибирования рост-пролиферативных генов.

Другая стратегия, используемая раковыми клетками, состоит в уклонении от необратимого окончательного дифференцирования клеток в постмитотическое состояние. Один пример этой стратегии включает транскрипторный фактор c-Myc, который стимулирует рост во время нормального развития, ассоциируясь с другим фактором, Max. Для индукции дифференцирования однако, Max формирует комплексы с Mad (Mad-Max комплексы) для инициирования дифференцирование-индуцирующих сигналов. Однако, в определенных опухолях, c-Myc онкопротеин повышенно экспрессируется, таким образом смещаясь баланс в сторону благоприятствования Myc-Max комплексов, таким образом, ингибируя дифференцирование и способствуя росту.

Хотя взаимосвязь между различными рост- и дифференцирование-индуцирующими сигналами с циклом клеточного деления все еще недостаточно ясна, очевидно, что понимание антиростовой сигнальной цепи является жизненно важным для понимания развития рака.

5. Избегание клеточной смерти (апоптоза)

Пока, мы смотрели на клеточные и молекулярные пути, которые позволяют или ограничивают клеточную пролиферацию. Конвергенция двух сигнальных путей, которые регулируют клеточную пролиферацию (прото-онкогенного и опухоль-супрессорного), диктует, войдет ли клетка в клеточный цикл, отклонится к состоянию покоя или вступит в постмитотическое состояние дифференцирования. Эта глава теперь сосредоточится на другом состоянии, где сигнальные пути мониторируют внутреннее благосостояние клетки. Клетка постоянно наблюдает за своим внутренним статусом, включая доступ к кислороду и питательным веществам, целостность ее генома и баланс клеточный цикл-регулирующих путей. Если этот мониторинг обнаруживает повреждение или дисфункцию, активируются резервные системы, которые, в свою очередь, определяют, должен ли клеточный рост прекратиться и репаративные пути активироваться, или альтернативно, если повреждение тяжело, клетка активирует латентные пути клеточной смерти (апоптотические).

Развитие опухолей можно рассматривать не просто как избыточную пролиферацию клеток, но также и как снижение в инциденте клеточной смерти. Программированная клеточная смерть — апоптоз  (от греч: apo — от, ptosis — падение, первоначально используемое для опадющих листьев осенью) — представляет главный источник этого снижения. Нарастает свидетельство для предположения, что избегание/резистентность к апоптозу является главным признаком большинства, если не всех, типов рака.

5.1 Когда наблюдается апоптоз?

Апоптотическая клеточная смерть — часть процесса нормального роста и развития. Например, создание пальцев рук или ног у человека  является результатом апоптоза клеток между пальцами. Другим является пример цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛф) иммунной системы, которые элиминируют инфицированные вирусом клетки благодаря апоптотическим путям и, таким образом, устраняют какие-либо грубые воспалительные или инфекционные последствия.

Гомеостаз тканей — это баланс между клеточным делением и клеточной смертью, благодаря чему число клеток в каждой ткани поддерживается на относительно постоянном уровне. Если это равновесие будет нарушено, то клетки будут или a) делиться быстрее, чем они могут погибнуть, приводя к развитию рака или b) гибнуть быстрее, чем они могут делиться, результируя в тканевую атрофию. В окончательно дифференцированных клетках, подобных нейронам, у индукции апоптоза может быть фатальное следствие, наблюдаемое при нейродегенеративных заболеваниях, таких как болезнь Альцгеймера.

Дисрегуляция этого сложного гомеостаза тканей вовлечена во многие формы рака. Например, определенные типы панкреатической аденокарциномы показывают активацию антиапоптотических путей.

5.2 Что инициирует апоптоз?

Индукция апоптоза может быть упрощена до 2 широких категорий

  1. Утрата позитивных сигналов: Депривация рост-стимулирующих факторов, таких как факторы роста, может инициировать апоптоз. Например, на ранних стадиях развития, нейроны, лишенные фактора роста нервов (NGF), умирают путем апоптоза
  2. Индукция негативными сигналами: Связывание определенных внешних молекул (лигандов), таких как смертельные лиганды, может инициировать внутриклеточный апоптотический сигналинг. Альтернативно, внутренние сигналы из клеток могут также активировать апоптоз. Например, апоптоз как правило наблюдается, когда повреждение клетки не поддается репарации, после инфицирования вирусом, или перенесения стрессорных состояний, таких как голодание/гипоксия.

Эти внешние или внутренние сигналы активируют апоптоз в высоко специфичной и координированной манере (подобно хорошо спланированному военному действию). В ответ на активацию клетка аккуратно демонтируется, клеточная мембрана подвергается блеббингу, хромосома фрагментируется и упаковывается в обособленные апоптотические организмы наряду с цитозолем, и отсутствуют лизис или утечка клеточного содержимого, которые, как правило, вызывают воспалительный ответ (Рис. 5.1). Все действие может занять всего 30-120 мин! Какое-либо сохранившееся свидетельство существования клетки устраняется соседними клетками, которые поглощают апоптотические тельца и рециклируют содержимое для собственного использования.

enindex19

enindex20

Рис. 5.1: Типы клеточной смерти.

a) Апоптотические (программированная клеточная смерть) сигналы ведут в системный демонтаж клетки в меньшие апоптотические тельца, которые поглощаются фагоцитами без воспалительного ответа.

b) Некроз — грубый путь клеточной смерти, который ведет к набуханию клеток и лизису, результируя в воспалительный ответ.

5.3 Как проявляется апоптоз?

Главные компоненты апоптотических путей могут делиться на 2 части — восприятие апоптотических сигналов и выполнение апоптоза. Воспринимающие пути мониторируют внутреннюю и внешнюю среду клетки для выявления изменений в окружающих условиях, которые могут влиять на клеточную судьбу (выживание, деление или смерть). Эти пути близко ассоциированы с путями выполнения — эффекторными путями, которые осуществляют задачу программированная клеточной смерти, демонтируя клетку.

Апоптотическое восприятие полагается на сигналы либо внешние (внешняя индукция), либо внутренние (внутренняя индукция) к клетке. Внешние сигналы включают экспозицию токсинам, определенным гормонам и т.д, которые трансдуцируются внутрь посредством или рецепторов, или транспортеров на плазматической мембране. Внутренние сигналы, с другой стороны, мониторируют ответ на стресс или повреждение ДНК. Например нагревание, излучение, гипоксия, недостаточность GF, вирусные инфекции или повышение внутриклеточного кальция все вызывают апоптоз через внутренние сигнальные пути. Возродившийся интерес к апоптозу привел к взрыву статей в этой области, и текущее понимание предлагает, что и внешние, и внутренние пути сходятся в общих эффекторных путях клетки.

enindex21

Внешний апоптотический сигналинг обычно медиируется рецепторами на клеточной поверхности, которые связывают факторы смерти или выживания (см. Рис. 5.2 внешний путь). Например, смертельные сигналы активируются, когда эндогенный лиганд (CD95L) связывается с рецепторами CD95 (также называемыми Fas рецепторами) на клеточной мембране. Другие примеры включают Tumour Necrosis Factor-α (TNF-α — фактор некроза опухоли α), связывающийся с TNF рецепторами (TNFR1), или FAS лиганд, связывающийся с FAS рецепторами на клеточной мембране. Утрата сигналов от внеклеточного матрикса и межклеточных адгерентных протеинов также стимулирует апоптоз в клетках.

Внутренние сигналы, которые вызывают апоптоз, конвергируют на митохондрии, аэробной энергостанции клетки (см. Рис. 5.2 Внутренний путь). Цитозольные протеины, такие как члены Bcl-2 семьи таргетируют митохондрии, вызывая или набухание органеллы, или делая ее  «протекающей», тем самым позволяя высвобождение определенных апоптотических эффекторных протеинов в цитозоль. Эти протеины включают SMACs (второй митохондрия-продуцируемый активатор каспаз), которые связываются с IAP (ингибиторы протеинов апоптоза) и дезактивируют их, позволяя апоптозу продолжаться.

Другой важный протеин утечки — цитохром c, который высвобождатеся из внешней митохондриальной мембраны через канал под названием MAC (Mitochondrial Apoptosis-inducing Channel — митохондриальный апоптоз-индуцирующий канал). В цитозоле цитохром c связывается с Apaf-1 и АТФ, которые затем связываются с прокаспазой-9 с формированием протеинового комплекса, известного как апоптосома. Формирование апоптосомы — финальная необратимая стадия апоптоза, когда каспаза 9 (инициатор) активирует экзекьютер апоптоза, эффекторную каспазу 3. Эти каспазы (caspases — cysteinyl aspartate-specific serine proteases — цистеинил аспартат-специфичные сериновые протеазы) являются окончательными эффекторами апоптоза, которые осуществляют клеточную смерть селективно демонтируя ключевые структурные белки и ДНК.

enindex22

Рис. 5.2. Внешние и внутренние апоптотические пути. 1) Внешние сигналы инициируются связываем лиганда (например. CD95L) с его рецептором (CD95). Эта активация рецептора ведет к активации FADD, который в свою очередь активирует DED. Активация DED запускает апоптозу через инициирующую каспазу 8, которая приводит к необратимому апоптозу либо прямо, либо через эффекторные каспазы (каспазу 3). Активная каспаза 8 расщепляет BID до tBID, который перемещается к митохондриону для высвобождения SMAC/DIABLO. SMAC/DIABLO секвестрирует IAP, результируя в индукцию апоптоза через каспазу 3.

2) Внутренний апоптотический путь инициируется в митохондрионе разнообразными стимулами. a | Сигнал о необратимом повреждении ДНК через p53 протеины устраняет супрессию апоптоза BCL2, приводя к мембранной проницаемости и высвобождению цитохрома c (Cyto c), SMAC/DIABLO, AIF (апоптоз-индуцирующий фактор) b |, Цитохром c взаимодействует с APAF1 для задействования и активации каспазы 9, формируя апоптосому, которая активирует последующие экзекьютерные каспазы 3 и 7. AIF вызывает деградацию ДНК.

FADD — Fas-associated death domain (Fas-ассоциированный смертельный домен); DED — Death Effector Domain (Смертельный Эффекторный Домен); tBID — truncated BID (усеченный BID); BID — [BH3 (BCL2 homology domain 3)-interacting agonist domain] ([BH3 (домен BCL2 гомологии 3) — взаимодействующий агонистический домен]); IAP — inhibitor of apoptosis ингибитор апоптоза); BCL2 — B-cell leukaemia/lymphoma-2 (В-лимфоцитарная лейкемия/лимфома 2); SMAC/DIABLO — second-mitochondrial-derived activator of caspases (второй-митохондрия-продуцируемый активатор каспаз); APAF-1 — apoptosis protease activating factor-1 (апоптозная протеаза-активирующий фактор-1)

Несколько изучений, используя трансгенные модели, ясно продемонстрировало, что изменение компонентов апоптотических машин может резко нарушить динамику опухолевой прогрессии, показывая, что инактивация этих машин — ключевой фактор во время развития опухоли.

Раковые клетки могут избежать апоптоза разными способами. Самый распространенный включает мутации p53 опухоль-супрессорного гена, результируя в утрату проапоптотических регуляторов. Более 50 % всех раковых образований человека (и 80% сквамозно-клеточных карцином) показывают инактивацию p53 протеина. P53 также известен как «опекун клетки» из-за его центральной роли в клеточном ответе на стресс.

Главная роль p53 как сенсор повреждения ДНК, и в ответ на повреждение ДНК он активирует или пути ДНК репарации, или апоптоз. Другие аномальные внутренние сигналы, такие как гипоксия или избыточная экспрессия онкогенных протеинов, также инициируют протеины, вовлеченные в апоптоз, направляемый частично через p53, и поэтому любая утрата функции p53 протеина ведет к нарушению программы апоптоза. Недавно, механизм для того, чтобы уменьшить апоптоз через FAS смертельный сигнал был продемонстрирован в высокой фракции легкого и клеточных линий карциномы толстого кишечника: несигнальный ложный рецептор для FAS лиганда сверх-регулируется, таким образом разбавляя смерть-индуцирующий сигнал FAS смертельного рецептора.

Текущая модель апоптотической сигнальной цепи показана на рисунке 5.2.

Хотя это — все еще часть продолжающегося исследования, ключевые регулирующие и эффекторные компоненты идентифицированы. Однако, некоторые вопросы сохраняются, у которых есть важные импликации для развития новых типов противоопухолевой терапии. Маловероятно, что все типы рака будут терять все протеины в проапоптотической цепи; более вероятно, что они сохраняют другие подобные протеины, которые активируют апоптоз. Вызов заключается в идентификации апоптотических путей все еще оперирующих в специфичных типах раковых клеток и проектирования новых препаратов, которые будут действовать на все популяции опухолевых клеток, ведя к реальному терапевтическому успеху.

6. Обеспечение роста кровеносных сосудов (ангиогенез)

Четыре признака канцерной прогрессии — автономия от ростовых сигналов, нечувствительность к антиростовым сигналам, резистентность к апоптозу и неограниченный репликационный потенциал — обсужденные в предыдущих главах смотрели на канцерную прогрессию на молекулярном и клеточном уровне. Однако, другие факторы, которые также играют важную роль в прогрессии и распространении канцера, нуждаются в понимании для развития лучших стратегий канцерной терапии.

Клетка и ткани нуждаются в кислороде и питательных веществах для выживания и роста и поэтому большинство клеток располагаются в пределах 100 мкм от капиллярного кровеносного сосуда. Как правило, клетки, которые выстилают капилляры — эндотелиальные клетки — не растут и не делятся. Однако, определенные состояния, подобные менструации или заживлению ран, инициируют деление эндотелиальных клеток и рост новых капилляров, и этот процесс называют ангиогенезом или неоваскурялизацией. Опухоли могут также «включать» ангиогенез. Фактически, это — ключевой переходный шаг в конвертации небольшого, безопасного кластера мутантных клеток (in situ опухоль) в большой злокачественный рост, способный к распространению в другие области. Обычно этот транзит может занимать много месяцев или даже лет и пока ангиогенез не будет активирован, солидные опухоли не буду вырастать больше горошины. Поэтому, понимание процесса неоваскурялизации в опухолях является сильной стратегией для разработки терапевтических стредств.

Как и с большинством других клеточных гомеостатических механизмов, ангиогенез также включает тонкий баланс между позитивными и отрицательными сигналами, которые стимулируют или блокируют этот процесс. Judah Folkman был среди пионеров, которые использовали in vivo определения биологической активности для демонстрации потребности в ангиогенезе для стремительного роста эксплантатов опухоли почти 30 лет назад. Мы теперь знаем, что способность индуцировать и поддерживать ангиогенез приобретается в серии обособленных шагов во время развития опухоли, через “ангиогенное переключение» (ангиогенный свич) из состояния покоя сосудов.

Упрощенное описание этого процесса, показанного на рисунке 6.1, дается ниже

  • Опухолевые клетки высвобождают проангиогенные факторы, такие как сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), которые диффундируют в соседние ткани и связываются с рецепторами на эндотелиальных клетках предсуществующих кровеносных сосудов, приводя к их активации.
  • Подобные взаимодействия между эндотелиальными клетками и опухолевыми клетками ведут к секреции и активации различных протеолитических ферментов, таких как матриксные металлопротеиназы (MMP), которые деградируют базальную мембрану и внеклеточный матрикс.
  • Деградация базальной мембраны позволяет активированным эндотелиальным клеткам — которые стимулируются для пролиферации факторами роста — мигрировать к опухоли.
  • Интегриновые молекулы, такие как avß3-интегрин, помогают ветвиться (спраутинг) новым кровеностным сосудам вперед.
  • Эндотелиальные клетки формируют новую базальную мембрану и секретируют факторы роста, такие как тромбоцит-продуцируемый фактор роста (PDGF), которые аттрактируют поддерживающие клетки для стабилизации нового сосуда.

enindex23

Рис. 6.1. Ангиогенез в процессе опухолевого роста. Опухолевые клетки высвобождают проангиогенные факторы, такие как сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), которые распространяются в соседние ткани и связываются с рецепторами на эндотелиальных клетках предсуществующих кровеносных сосудов, приводя к их активации. Такие взаимодействия приводят к секреции и активации различных растворимых протеаз (таких как матриксные MMP металлопротеиназы), которые деградируют базальную мембрану и внеклеточный матрикс. Деградация позволяет активированным эндотелиальным клеткам делиться и мигрировать к опухоли. Интегриновые молекулы помогают вытянуть распространяющийся (спраутинг) новый кровеностный сосуд вперед. Эндотелиальные клетки формируют новую базальную мембрану и секретируют факторы роста, такие как тромбоцит-продуцируемый фактор роста (PDGF), которые притягивают поддерживающие клетки для стабилизации нового сосуда.

Однако, вопрос, как тонкий баланс между различными ангиогенными регуляторов смещается в сторону активирования прогрессии опухоли все еще не понят. Наиболее вероятный сценарий — то, что может существовать внутренняя связь с другими сетями, вовлеченными в клеточный гомеостаз. Например, ангиогенный ингибитор тромбоспондин-1 положительно регулируется p53 опухоль-супрессорным протеином в некоторых типах нормальных клеток. Поэтому, любая утрата p53 функции, которая наблюдается в большинстве опухолей человека, может вести  к падению уровня тромбоспондина-1, таким образом устраняя ингибиторный барьер для пролиферации эндотелиальных клеток.

Другим свидетельством являются протеазы, которые могут контролировать доступность ангиогенных активаторов и ингибиторов. Некоторые протеазы могут высвобождать ангиогенные факторы, депонированные во внеклеточном матриксе, тогда как другие обладают и проангиогенными, и антиангиогенными функциями (подобно плазмину). Скоординированная экспрессия про-и антиангиогенных сигнальных молекул и их контроль протеазами, видимо, играют важную роль в сложной гомеостатической регуляции тканевого ангиогенеза.

На упрощенном уровне ангиогенез опухоли предлагает убедительную и притягательную терапевтическую мишень, у которой есть широкое применение почти для всех солидных опухолей. Несколько антиангиогенных препаратов показали обещание в поздних клинических исследованиях, и несколько перспективных препаратов, таргетирующих ангиогенные регулирующие молекулы, находятся в процессе испытания. Однако, доступное свидетельство также показывает, что различные типы опухолевых клеток используют различные молекулярные стратегии активации ангиогенного переключения. Это поднимает вопрос того, будет ли единственное антиангиогенное средство достаточным для лечения всех типов опухолей, или необходимо развивать селективную терапию для специфичных типов опухолей, с таргетингом специфичного ангиогенного переключения.

7. Распространение в другие области (метастазирование)

Солидные опухоли, как правило, являются частью нормальных тканей, и при оптимальных условиях, могут инвазировать смежные ткани или, поступая в кровеносную систему, колонизировать отдаленные области организма. Эти вторичные опухоли — метастазы- ответственны почти за 90% канцер-ассоциированных летальных исходов. Способность опухолевых клеток инвазировать и метастазировать является завершением шести признаков рака. Метастазы позволяют опухолям выживать и расти в новой среде, где отсутствуют ограничения пространства или питательных веществ. Недавно сформированные вторичные опухоли могут содержать раковые клетки и некоторые нормальные поддерживающие клетки, задействованные из нормальных тканей. Как и любая другая опухоль, метастатические опухоли также показывают нарушения в сигнальной цепи как описано в других 5 признаках.

Однако, метастатические опухоли показывают дополнительные уникальные клеточные черты, которые позволяют им меняться и адаптироваться к их новой среде. Точный механизм инвазии и метастазирования представляет сложный процесс и является субъектом интенсивных исследований, но включает обычную стратегию физического заселения раковых клеток в новую область путем активации внеклеточных протеаз.

Раковые клетки напоминают плохих фокусников, когда дело доходит до инвазии и метастазирования. «Гудини» клеточного мира — лейкоцит иммунной системы. В ответ на инфекцию эти клетки покидают кровеносную систему и направляются в окружающие ткани. Лейкоцитам требуется меньше минуты для «понуждения» эндотелиальных клеток капиллярной стенки к ретракции,  позволяя им вступать в ткань для атаки на возбудители инфекции (процесс, названный дипедезисом). Раковые клетки однако полагаются на грубую силу для инвазии в окружающую ткань, главным образом вследствие утраты ими необходимых биохимических механизмов, и им может потребоваться до 24 часов для завершения процесса.

enindex26

Возрастает ли риск метастазирования с увеличением размера опухоли?

Изучение 1589 пациентов с раком молочной железы (рисунок справа) показывает повышенный риск развития отдаленных метастазов с увеличением грубого объема опухоли. Например, только 22 % женщин с размером опухоли менее 1 см имели метастазы по сравнению с 77 % женщин с опухолями более 10 см. Однако, вопрос, приобретены ли мутации, необходимые для метастазирования, в раннем или позднем периоде канцерной прогрессии, все еще неразрешен.

7.1. Каковы стадии метастазирования?

Миграция раковых клеток от первичной локализации в отдаленную область — сложный биологический процесс, который включает изменения на молекулярном, клеточном и физическом уровне. Коротко, каскад инвазии и метастазирования обычно включает следующие стадии (Рис. 7.1)

  1. Локальная инвазия. в этом процессе небольшая in situ опухоль прорывается за барьер базальной мембраны
  2. Интравазация.  Опухолевые клетки перемещаются через стены капилляров или лимфатических сосудов в кровеносную систему. Это — критический шаг метастатического пути, и включает сложное, морфологическое изменение, лагодаря которому раковая клетка приобретает свойства инвазивности и клеточной подвижности. Это позволяет раковой клетке проложить свой путь через капиллярную стенку в кровеносную систему.
  3. Транспорт. Раковые клетки перемещаются с кровью или лимфой, пока не фиксируются на солидной поддерживающей ткани. Хотя и кровь, и лимфа ответственны за транспорт, большинство отдаленных метастазов связаны с кровотоком. На данном этапе, большинство раковых клеток может теряться или разрушаться во враждебном окружении. Однако, выживающие раковые клетки получают доступ к тканям в первом наборе капилляров, с которыми они взаимодействуют (главным образом, благодаря крупным клеткм, блокирующим небольшой пассаж по капиллярам) и формируют микротромбы.
  4. Экстравазация. Этот конечный шаг миграции чрезвычайно подобен интравазации, но главное отличие в том, что направление движения полностью обратно. Раковые клетки в микротромбах теперь проталкиваются через капиллярную стенку и напавляются в тканевую среду.
  5. Формирование микрометастазов. В процессе экстравазации, раковые клетки начинают реактивировать клеточные пролиферативные пути и формировать небольшую опухолевую массу, которая или развивается в полости капилляра или через стенку сосуда.
  6. Колонизация. Это — наиболее сложная стадия, главным образом, поскольку новая среда не всегда может обеспечивать необходимыми для роста факторами выживания и пролиферации. Большинство раковых клеток как правило гибнет или остается в живых в течение длительных периодов как микрометастазы (которые намного труднее обнаружить)

enindex27

Рис. 7.1. Биологические пути метастазирования рака.

7.2. Ключевые молекулы, вовлеченные в метастазирование

Однако, завершение всех 6 шагов, отмеченных ранее, наблюдается не всегда, и процесс метастазирования высоко неэффективен, с колонизацией как наименее эффективны шагом. Для превращения опухолевой клетки в метастатическую необходимы несколько изменений, разрешающих интра-, экстравазацию и колонизацию. Сложность этого процесса иллюстрируется карциномными клетками. Эти раковые клетки активируют цикл клеточного дифференцирования, названный ЭМТ (эпителиально-мезенхимальный транзит) путем индукции экспрессии нескольких ЭМТ-разрешающих транскрипторных факторов. Это позволяет раковой клетке приобрести характеристики мезенхимальных клеток, такие как инвазивность и подвижность.

Эти изменения в характеристиках включают несколько протеинов, ответственных за тканевую инвазию и распространение, и некоторый из ключевых игроков выделены ниже

a)   Одними из наиболее важных протеинов являются межклеточные адгезивные молекулы (CAM), главная роль которых заключается в закреплении клетки в окружающей ткани. Среди CAM, самый распространенный протеин, вовлеченный в метастазирование, — E-кадгерин, найденный во всех эпителиальных клетках. В нормальных клетках E-кадгерин действует как мостик между смежными клетками, устанавливая цитоплазматический контакт и разделяя внутриклеточные сигнальные факторы, ответственные за ингибирование способности к инвазии и метастазированию. Большинство эпителиальных раковых образований демонстрируют утрату E-кадгериновой функции, и эта элиминация играет значительную роль в способности к метастазированию.

b)   Другой класс протеинов, вовлеченных в тканевую инвазию, является интегринами, широко распростаненной семьей гетеродимерных трансмембранных адгезивных рецепторов, которые связывают клетки с внеклеточным матриксом. Дополнительно к роли в ангиогенезе они также играют центральную роль в клеточной адгезии и миграции, контроле клеточного дифференцирования, пролиферации и выживания. Изменения в экспрессии интегринов также очевидны в инвазивных и метастатических клетках. Успешная колонизация новых областей (и локальных, и отдаленных) требует адаптации, которая достигается путем изменения субъединиц интегринов, показанные мигрирующими клетками. Например, карциномные клетки облегчают инвазию, предпочтительно экспрессируя интегриновые субъединицы, необходимые для связывания с деградированными внеклеточными протеазами стромальными компонентами.

c)   Другая стратегия для успешной колонизации — повышенная экспрессия внеклеточных протеаз (подобных MMP — Matrix MetalloProteinases Матриксные Металлопротеиназы) наряду с уменьшением уровней протеазных ингибиторов. Клетки в строме рядом с раковыми клетками секретируют активные протеазы, которые облегчают инвазию благодаря деградации компонентов внеклеточного матрикса. Это позволяет раковым клеткам мигрировать за границы кровеносного сосуда и через слои нормальных эпителиальных клеток.

Все упомянутые выше протеины являются витальными для инвазивной и метастатической способности. Однако, регулирующие и молекулярные цепи, видимо, отличаются в средах различных тканей, и их точные роли в различных типах опухолей являются высоко вариабельными. Инвазия и метастазирование представляют последнюю большую область для исследования канцера. Вызов заключается в применении нового молекулярного понимания тканевой инвазивности и метастазирования для развития эффективных терапевтических стратегий.

8. Заключение

Шесть признаков рака, описанного пока, предполагают, что прогрессия опухоли наблюдается благодаря мутациям ДНК в генах, вовлеченных в регулирование клеточных сигнальных и метастатических путей. Однако, геномная целостность поддерживается тонко армией мониторирующих и репаративных ферментов в клетке. Порядок хромосомного дублирования также сильно защищается в контрольных точках клеточного цикла. Поэтому мутации должны быть чрезвычайно редкими реакциями, настолько редкими, что не могут наблюдаться в течение жизни человека.

Тем не менее раковые образования наблюдаются в 33% человеческой популяции в среднем. Это означает, что опухоли должны так или иначе иметь выше частоту мутаций, чем предсказанная с сигнальными путями? Одна школа утверждает, что возможно мутации в генах смотрителях (caretaker) или опекунах (guardian) ответственны за эту повышенную мутацию. Наиболее убедительное свидетельство для этого аргумента прибывает из мутаций в p53 опухоль-супрессорном протеине, найденных в огромном большинстве опухолей человека. Он играет центральную роль в определении клеточной судьбы в ответ на повреждение ДНК; клеточный цикл должен быть остановлен и репаративные пути должны быть включены, или клетке необходимо позволить погибнуть апоптозом? Кроме того, другие протеины, вовлеченные в восприятие и репарацию, также функционально теряются в различных раковых образованиях. Нестабильность генома, генерируемая в результате, является возможно другой витальной предпосылкой, необходимой для прогрессии опухоли ко всем шести биологическим признакам.

Приобретение различных мутаций в сигнальной цепи, описанная выше, является высоко переменной в терминах времени и тканевого типа. Например, мутации в p53 могут быть найдены в субпопуляции в других отношениях идентичных опухолей, или некоторые онкопротеины могут экспрессироваться рано в некоторых типах опухоли, и поздно в других. Поэтому последовательность экспрессии шести признаков рака может широко варьировать между опухолями одного типа и большинстве случаев, конечно, в различных опухолевых типах. Тем не менее, почти все раковые образования в конечном счете показывают те же самые шесть признаков прогрессии опухоли.

Исследование биологии рака выдало изобилие информации относительно инициирования и прогрессии канцера, и также результировало в драматическое развитие новых препаратов для борьбы против рака. Упрощение и диссекция путей, вовлеченных в каждый из этих сигнальных путей, являются витальными в понимании этого процесса. С другой стороны, опасность упрощения состоит в том, что оно отражает небольшую биологическую действительность канцерной прогрессии у пациентов in vivo. Эмпирическое свидетельство in vitro часто было не в состоянии согласовать результаты от in vivo изучений. Это привело к глубокому переосмыслению и изменению экспериментального изучения рака. Подходы на системном уровне (гетеротипические органные культуры in vitro, очищенные животные модели и даже трансляционная медицина) помогут нам составить подробные карты раковых сигнальных сетей.

Новые технологии позволили нам идентифицировать эпигенетические модификаторы (агенты, которые модифицируют экспрессию, не меняя ДНК последовательность — такие как микроРНК), расположенные или в раковой клетке или где-то еще в организме. Наиболее вероятно, что в ближайшем будущем, диагноз всех раковых образований положится на обычный анализ профиля экспрессии массива лежащих в основе генетических мутаций и / или их эпигенетических модификаторов. Появляющиеся технологии могут также помочь нам понять сложные взаимодействия между различными компонентами этих сложных сигнальных сетей. Это — только вопрос времени прежде, чем ‘полная интегральная схема’ раковой клетки сможет быть закончена, и мы понимаем, почему протираковые препараты эффективны или терпят неудачу.

Цели для будущего будут состоять в обнаружении и идентификации всех стадий прогрессии болезни, препятствовать развитию рака, при этом леча предсуществующие раковые образования.

1 Response

  1. Елена:

    Познавательно. Спасибо.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

Яндекс.Метрика